Topo克隆系列专题
——简单、快速、高效的克隆策略
关键词:Topo克隆 载体 连接反应 TA克隆 blunt载体 zero载体
Topo克隆技术是通过TOPO载体上偶联的异构酶(Topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。不同于传统的TA克隆,Topo克隆技术能够在2-5min内快速完成插入片段和载体的连接反应,操作简单,连接效率极高,克隆阳性率接近100%。
背景
传统的TA克隆对于PCR产物的要求较高,而且连接反应时间很长,同时阳性率低,而且自连率很高,无形中会成倍地增加科研者宝贵的时间。翊圣生物推出Hieff CloneTM TOPO系列克隆载体,能够快速而且高效地得到目的重组载体。Hieff CloneTM Zero TOPO载体为零背景载体,载体骨架中含有**ccdB基因。此克隆方法无需蓝白斑筛选,阳性率100%。
Hieff CloneTM Zero TOPO Simple系列载体,不含多克隆酶切位点(MCS)使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时,不会受到载体MCS位点的影响,从而增加了克隆成功率。
TOPO克隆原理
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Topo载体两端通过磷酸键偶联Topo酶,连接反应时,受插入片段的5’端羟基的攻击,磷酸键释放能量。利用该能量,插入片段5’端羟基与载体片段3’端磷酸基团连接在一起,Topo异构酶从载体分子上脱落,完成连接反应。 |
零背景载体:Hieff CloneTM Zero Topo载体骨架中含有ccdB致死基因。当载体发生自连时,ccdB基因完整,会表达ccdB毒素蛋白,导致细菌死亡;当插入片段成功连接时,ccdB基因不完整,ccdB基因不能完整表达,细菌存活。 |
TOPO克隆与传统TA克隆方法的比较
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反应时间 |
反应温度 |
体系组成 |
克隆阳性率 |
PCR产物 |
Zero TOPO |
2-5min |
室温 |
载体+插入片段 |
★★★★★ |
Blunt载体无需加“A” |
传统TA克隆 |
过夜 |
16℃ |
载体+插入片段+T4连接酶 |
★★ |
需要加“A” |
产品特点
快速:仅需2-5分钟即可完成连接反应
高效:无自连现象,阳性克隆率100%
简便:只需加入目的片段即可
操作流程
产品实例
连接效率高,克隆阳性率极高
图1:Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5kb基因,成功率100%。A-C:TOPO克隆转化平板。D-F:插入片段PCR鉴定电泳图。
同类产品比较:
图2:相同体系下,克隆3kb目的基因,Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit较同类产品具有高连接效率。
FAQ
Q1:从质粒上酶切的产物可直接连接Topo载体吗?为什么?
A:Topo载体进行连接反应的时候需要5`羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5`羟基端没有磷酸化,可以直接进行TOPO克隆。但是,酶切产物5`端为磷酸化状态,可以直接进行TA克隆的,但是不能进行Topo克隆。如果需要,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理后连接Topo载体。
Q2:连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗?
A:建议反应体系应控制在10μl内,体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低,建议浓缩之后再连接,以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般1-2min即可完成连接反应,若想得到更多克隆,可适当延长至5min,但不能超过5min。室温反应即可。
Q3:如何选择合适的载体?
A:若PCR产物为Taq酶扩增则选择TOPO-TA克隆载体系列,若PCR产物为高保真酶扩增则选择Blunt载体系列,。Simple载体不含多克隆位点区,可根据客户需求在PCR扩增时添加自己需要的酶切位点。
Q4:若是储存了很久的PCR产物还能用来做克隆吗?
A:建议采用新鲜的PCR产物会使连接效率更高一些,若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免PCR产物的反复冻融和降解。
Q5:PCR扩增产物需要纯化吗?
A:先对PCR产物跑胶鉴定,若是PCR产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。
产品信息
名称 |
货号 |
规格 |
价格(元) |
Hieff Clone™ Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit, MCS-Depleted |
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地 址: 上海市浦东新区天雄路166弄一号楼三层南单元 联系人: 李自转 电 话: 400-6111-883、021-34615995-8075 传 真: 021-34615995-188 Email:lizizhuan@yeasen.com 相关咨询邀请函 | 扬帆海外!翌圣邀您同聚 AACR 2025! (2025-04-29T00:00 浏览数:8251) 翌圣荧光素酶报告基因检测试剂:ICH指南预验证赋能药物精准研发 (2025-04-27T00:00 浏览数:9271) 限量试用 | RNA连接酶再上新!T4 RNA Ligase 2截短型,small RNA建库研究首选工具 (2025-04-27T00:00 浏览数:9703) 福利 | 成为翌圣知识分享官,赢取专属好礼~ (2025-04-27T00:00 浏览数:10694) 直播预告 | NGS 技术如何应用于癌症基因靶点精准 “扫描”? (2025-04-27T00:00 浏览数:11409) 精品推荐 | RNase A究竟有何魔力?揭秘其多元应用 (2025-04-27T00:00 浏览数:8932) 邀请函 | 翌圣邀您参加北京神经科学发展论坛! (2025-04-27T00:00 浏览数:12583) 从来源到应用!揭秘DNase I的全方位价值! (2025-04-24T00:00 浏览数:11995) 深耕本土,翌圣国产HCD&HCP质控产品线全方位多领域持久蓄力! (2025-04-24T00:00 浏览数:13989) 硬核研发+智造实力,翌圣生物全品类国产分子酶矩阵,破解进口酶"卡脖子"困局! (2025-04-24T00:00 浏览数:13916) ADVERTISEMENT
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