这篇文章探讨了益生菌及其代谢产物亚精胺(Spermidine, SPD)如何增强IFN-γ⁺CD4⁺T细胞免疫反应以抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)。全球约有2.96亿人慢性感染HBV，这增加了肝硬化和肝细胞癌的风险，使HBV成为最严重的传染病之一。世界卫生组织的目标是到2030年将HBV发病率减少95%，死亡率减少65%。理想的HBV抗病毒治疗目标是实现功能性治愈，即持续抑制HBV DNA并使血清乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface Antigen, HBsAg)消失。然而，实现慢性HBV感染的功能性治愈是困难的，自然历史成功率不到1%，即使长期治疗，现有抗病毒药物的成功率也不到5%。因此，恢复T细胞免疫和实现HBV感染的功能性治愈是研究的重点。

在5周龄的C57BL/6小鼠体内通过水动力注射(Hydrodynamical Injection, HDI)腺相关病毒/HBV1.2(AAV/HBV1.2)质粒制备了HBV携带者小鼠模型，从HDI前2周（BLE Pre组）或注射后3天（BLE组）开始，每天灌胃BLE（图1A）。如图1B-E所示，BLE和BLE Pre均能显著抑制HBV复制，表现为血清HBsAg、HBV DNA以及肝脏前基因组RNA(pgRNA)和HBV RNA水平降低。与此一致的是，在注射后6周内，给药BLE显著降低HBsAg阳性小鼠的百分比(wpi)（图1F）。

通过16S rRNA测序，研究者发现益生菌处理的小鼠肠道微生物组发生了显著变化，包括Prevotellaceae、Clostridiaceae、Akkermansia和Ruminococcaceae等家族的富集（图2C），这些家族被认为有助于通过抗PD-1或CTLA-4抗体恢复耗尽的CD8⁺T细胞。此外，益生菌处理的小鼠粪便中BLE（B. longum, L. acidophilus, 和E. faecalis）的丰度显著增加（图2D），表明益生菌在肠道中的积累。

收集PBS或BLE处理的HBV携带小鼠（供体小鼠）的粪便。使用受体小鼠进行FMT实验，在5周龄时，用抗生素混合物(ABX)治疗14天，然后用HBV HDI对其进行肠道消毒（图2E）。如图2F-2H所示，移植BLE小鼠粪便微生物群(FMT-BLE)可显著促进受体小鼠对HBV的清除，与接受对照粪便微生物群(FMT-Control)的小鼠相比，血清HBsAg和HBV DNA水平明显降低，肝脏pgRNA表达明显降低。同样，FMT-BLE小鼠中HBsAg阳性小鼠的百分比明显低于FMT-Control小鼠（图2I）。

为了进一步验证BLE在HBV清除中的直接作用，引入无菌(GF)小鼠，通过HDI建立HBV模型，然后给予益生菌（图2J）。与无特定病原体(SPF)小鼠的结果一致，添加BLE大大增加了GF小鼠粪便中BLE的数量（图2K），降低了血清HBsAg、HBV DNA和肝脏pgRNA的水平（图2L）。综上所述，这些数据表明BLE的积累有助于小鼠的HBV清除。

进一步探究CD4⁺T细胞亚群在BLE介导的HBV清除中的作用（图3D-L），RT-qPCR与FCM检测显示，BLE处理使小鼠肝脏Th1细胞相关转录因子和细胞因子表达上调，(T-bet)⁺Th1细胞增多。ELISA和FCM分析表明，肝脏匀浆IL-21、IFN-γ水平，以及Th1细胞中二者表达显著增加。此外，BLE处理提升了脾脏CD8⁺T细胞IFN-γ产量，增加无菌小鼠肝脏和脾脏IFN-γ⁺CD4⁺T细胞数量。上述结果表明，给予BLE能够使宿主通过增强CD4⁺Th1细胞中IL-21和IFN-γ的产生来清除HBV。

研究者发现，益生菌影响宿主的微生物代谢。通过飞行时间质谱联用系统(GC-TOF-MS)检测了BLE处理小鼠粪便中的代谢物变化。结果显示，38种代谢物在对照组和BLE处理组小鼠之间存在显著差异，其中包括亚精胺(SPD)（图4A)。进一步的靶向代谢组学分析表明，SPD在BLE处理的小鼠肝脏中积累，并且其浓度高于腐胺(putrescine)。重要的是，亚精胺在BLE处理的GF小鼠的粪便、外周血清和肝脏中积累（图4B），表明BLE产生的亚精胺可能通过血液循环从肠道转移到肝脏。

采用传统的细菌培养方法获得培养上清并检测SPD浓度。发现在含精氨酸的培养基中，培养的BLE在pH 5.0时产生的SPD水平明显高于pH7.0（图4C）。此外，给药BLE在抗生素(ABX)处理小鼠的粪便、肝组织和血清中产生的SPD水平明显较高，而单独的粪肠杆菌在体外和体内都不能有效产生SPD（图4C）。因此，BLE能有效地产生SPD并增强抗HBV免疫，粪肠杆菌能在长芽胞杆菌和嗜酸乳杆菌的协同下产生SPD。

进一步研究SPD在HBV清除中的作用。发现SPD单独给药可显著降低HBV携带者小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝脏pgRNA水平（图4D-4F）。综上所述，这些结果表明，BLE来源的SPD通过外周循环从肠道积累到肝脏，这有助于小鼠的HBV清除。

研究者进一步探索了SPD介导的HBV清除背后的机制，包括肠道稳态和T细胞免疫。结果显示，亚精胺喂养的小鼠显示出肠道紧密连接蛋白表达的显著增加，伴随着血清FITC-葡聚糖和iFABP水平的明显降低。此外，SPD喂养导致肠道IL-17A、IL-21和IL-22表达的显著增加，以及肠道IL-17A⁺CD4⁺T细胞、IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-22⁺CD4⁺T细胞的百分比和MFI的增加。亚精胺还增强了HBV携带小鼠肝脏和脾脏中IL-21⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD4⁺T细胞的频率（图4G和4H），ELISA证实SPD小鼠肝脏匀浆中IL-21和IFN-γ水平显著升高（图4I），提示SPD增强了HBV携带者小鼠的CD4⁺T细胞免疫。

用有或没有SPD的ovabumin(OVA323-339)肽刺激OT-II小鼠的体外脾细胞。FCM证实SPD以剂量依赖性方式增强ova刺激的OT-II CD4⁺T细胞中IFN-g的产生（图5A）。同时，SPD剂量依赖性地促进了OT-II CD4⁺T细胞中自噬体的积累（图5B），而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA, 1 mM)进一步增强了SPD诱导的自噬体积累（SPD+3-MA，图5C），提示SPD处理的CD4⁺T细胞中自噬活化。值得注意的是，3-MA显著降低SPD诱导的CD4⁺T细胞中IFN-g的增加（图5D）。

SPD是真核翻译起始因子5A(eIF5A)的唯一已知底物，elf5a通过选择性翻译调控tfeb蛋白表达。用GC7(SPD+GC7)（eIF5A的特异性抑制剂）处理，减少了SPD诱导的自噬体的积累（图5C），并完全破坏了SPD诱导的IFN-γ在CD4⁺T细胞中的积累（图5D）。与此一致的是，SPD诱导HBV携带者小鼠肝脏CD4⁺T细胞中的自噬体积累（图5E）。更重要的是，SPD显著促进了来自HBV患者外周血的CD4⁺T细胞中自噬体和IFN-γ的积累，而GC7的治疗在很大程度上破坏了这种诱导（图5F和5G）。综上所述，这些数据表明SPD以自噬依赖的方式增强CD4⁺T细胞的功能。

为了评估益生菌在自然微生物组中是否会引起类似的改变，并评估BLE和亚精胺在HBV清除中的临床治疗潜力，研究者通过用HBV患者的粪便样本重建GF小鼠的微生物群，构建了人类菌群相关(HFA)小鼠模型。结果显示，BLE和SPD在HFA小鼠中显示出显著的HBV清除能力。与对照组相比，BLE/亚精胺处理的HFA小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝内pgRNA水平显著降低（图6B-D）。BLE和亚精胺显著促进了肝内CD4⁺T细胞中自噬体的积累（图6E），并增强了肝脏和脾脏CD4⁺T细胞中IFN-γ的产生（图6F）。更重要的是，BLE和SPD都显著增强了肝脏和脾脏HBV特异性CD4⁺T细胞中IFN-γ的产生，表明BLE和SPD对HBV特异性免疫的潜在贡献（图6G）。

对血清HBsAg持续低水平（低于2000 IU/mL）的HBV患者进行BLE联合抗病毒治疗的临床效果进行了初步观察，这些患者通常被认为是功能治愈的有利人群趋势(图6h)。与对照组相比，接受BLE治疗6个月的患者血清HBsAg和HBeAg明显下降（图6I）。正如预期的那样，补充BLE显著促进外周血单核细胞(PBMCs)CD4⁺T细胞中自噬体的积累和IFN-γ的表达（图6J和6K）。

基于SPD在T细胞激活和HBV清除中的作用，研究者进一步确定亚精胺是否能够增强恩替卡韦(ETV)的治疗效果。结果显示，与ETV单药治疗相比，ETV和亚精胺的联合治疗组在HBsAg和pgRNA水平上显示出更显著地降低，同时对HBV DNA的抑制效果与单药治疗相当（图7A-D）。

这项研究表明，益生菌和其代谢产物亚精胺通过自噬增强IFN-γ⁺CD4⁺T细胞免疫反应，有效促进HBV的清除。这些发现为使用益生菌和亚精胺与抗HBV药物联合治疗慢性HBV感染提供了可能的治疗线索。尽管这项研究在人类中的样本量较小，但数据仍然显示了益生菌在实现HBV功能性治愈方面的潜力。未来的研究需要通过前瞻性随机对照试验来验证这些初步观察结果，并进一步探索益生菌和亚精胺在HBV治疗中的作用机制。